Um oligonucleotídeo (ou oligonucleótido) é um fragmento curto de uma cadeia simples de ácido nucleico (ADN ou ARN), tipicamente com 20 ou menos bases.
Os oligonucleotídeos são frequentemente usados como sondas para detectar ADN complementar ou ARN porque eles se ligam prontamente aos seus complementares. Exemplos de procedimentos que utilizam oligonucleotídeos são os microarrays de ADN, Southern blots e hibridização fluorescente in situ.
Os oligonucleotídeos compostos por ADN (desoxioligonucleotídeos) são frequentemente utilizados em PCRs, um procedimento que pode ser empregue afim de amplificar quase todos os pedaços de ADN. Neste exemplo, o oligonucleotídeo é frequentemente chamado de iniciador (termo em inglês: primer), e um curto pedaço de ADN que se liga à sua sequência, alvo complementar. Esta gera um local para a polimerase se ligar e estende o iniciador através da adição de nucleotídeos a fim de fazer uma cópia da sequência alvo.
É a molécula responsável pelo início dos processos que geram cópia da molécula original de ácido nuclêico (replicação, transcrição, transcrição reversa ou amplificação sintética de ácidos nuclêicos, como PCR).
